甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

摘要：【目的】在PCR的基本程序上，以甘蔗宿根矮化病菌Lxx16S-23SrDNA内部转录间隔区特异性引物，优化PCR反应条件，以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术。【方法1以Lxx基因组DNA为模板，采用TaKaRa的ExTaqPolymerase和2×GCBufferⅡ，调整退火温度和引物浓度等主要因子，优化PCR反应体系；稀释Lxx基因组DNA模板的浓度，检测优化PCR的灵敏度；用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定。【结果】优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx16S-23SrDNA内部转录间隔区序列；能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA（15．9pg／μL）中检NNLxx，而常规的PCR只能从稀释100倍的Lxx基因组DNA（159pg／μL）中检测到Lxx，且出现假阴性，不稳定。对田间生长的甘蔗品种GTll叶片总DNA进行PCR检测，结果用优化后的PCR检NRSD感染率为66．7％，而常规的PCR检NRSD感染率为0。【结论】优化的PCR体系为：2×GCBufferlⅡ2．5μL，ExTaqDNA酶（5U／μL）0．2μL；dNTP（2．5mmol／L）1．5μL；Lxxl（10μmol／L）1.0μL，Lxx2（10μmol／L）1．0μL，DNA模板1．0txL，用ddH20双蒸水补足至25．0μL。PCR反应程序为：95℃预变性10min，94℃15s，57℃15s，72℃30s，40＋循环；72℃延伸10min。优化的PCRtL常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高，更适合于田间大批量样品快速检测。