微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达

摘要：【目的】开发具有高表达活力的耐热耐酸新型真菌α-淀粉酶,研究其酶学性质和催化活性,探讨其潜在工业应用潜力。【方法】采用RT-PCR从嗜热真菌微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）中克隆耐热α-淀粉酶基因,并命名为RpAmy。以质粒pPIC9K为表达载体,将α-淀粉酶基因（RpAmy）转入毕赤酵母（Pichia pastoris）表达宿主KM71,进行异源表达,并测定动力学参数和酶学性质,分析水解淀粉的产物。【结果】克隆得到嗜热真菌微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）耐热α-淀粉酶基因,其开放阅读框全长1416 bp,编码471个氨基酸,与米根毛霉α-淀粉酶的氨基酸序列相似性最高（56.0%）。RpAmy在毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71中表达,最高酶活达到32100.0 U/mL,蛋白表达量为1.5 mg/mL;测定纯化后RpAmy比活力、Km和Vmax,分别为6745.9 U/mg、2.26 mg/mL、0.2875 mg/mL·min;最适pH和最适温度分别为pH 4.0、70℃;具有较宽的pH耐受性（4.0~9.0）和较高的温度耐受性（60℃）;水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖（69.0%,w/w）和葡萄糖（22.0%,w/w）。【结论】从微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）中克隆得到α-淀粉酶基因（RpAmy）,其可在毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71中高效异源表达并得到α-淀粉酶RpAmy。该酶具有较好的耐酸耐热性质,并能水解淀粉产生高麦芽糖含量的糖浆,在工业应用方面具有很大的潜力。