鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

作者: 赵冬敏韩凯凯刘青涛黄欣梅杨婧刘宇卓章丽娇田宇杰王梦瑶

关键词: 坦布苏病毒鸭胚成纤维细胞热休克蛋白70 受体免疫共沉淀病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)

摘要：[目的]拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础.[方法]取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用.[结果]DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70).含重组质粒pET32a-HSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应.以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染.[结论]HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计.

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鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

作者: 赵冬敏 韩凯凯 刘青涛 黄欣梅 杨婧 刘宇卓 章丽娇 田宇杰 王梦瑶

关键词: 坦布苏病毒 鸭胚成纤维细胞 热休克蛋白70 受体 免疫共沉淀 病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)

作者: 赵冬敏韩凯凯刘青涛黄欣梅杨婧刘宇卓章丽娇田宇杰王梦瑶

关键词: 坦布苏病毒鸭胚成纤维细胞热休克蛋白70 受体免疫共沉淀病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)